Precauções para eletroforese em gel de poliacrilamida

· poliacrilamidao gel deve ser composto por monômero de acrilamida, material de partida de polimerização, catalisador e a mistura certa de sal e tampão juntos.

· acrilamidae BIS (N,N'-metileno duplo acrilamida) é a matriz de gel em forma de monômero.

· O persulfato de amônio inicia o processo de polimerização do adesivo. A formulação da cola requer uma solução de persulfato de amônio a 10% preparada em água. A maioria das informações indicou a necessidade de uso ativo. No entanto, a solução a 10% pode ser mantida a 4°C por várias semanas sem perda significativa de atividade. Complete até 10 ml e descarte se a cola não agregar mais.

Dica: A porcentagem deacrilamidaNo sequenciamento, cola e cola proteica não são a mesma coisa. Se usar solução de acrilamida:BIS pré-fabricada, certifique-se de obter o frasco correto.

· TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina) é um catalisador, em frasco marrom, mantido na geladeira. Adicione imediatamente antes de despejar a cola.

· O vidro usado na eletroforese de poliacrilamida deve ser lavado antes e depois de cada eletroforese. Após a eletroforese, lave com uma escova macia e um pano em água quente com sabão, enxágue com água destilada e deixe secar.

· umidade e poeira podem causar problemas com polímeros ocos. Antes da eletroforese, limpe a placa de vidro com limpador de vidros e esfregue-a com uma escova macia. Lave com água destilada e seque bem com um lenço de papel. Enxaguar com etanol 70% antes de esfregar com papel ajuda a limpar e acelerar a secagem. Adicione as amostras de acrilamida sucessivamente: BIS, água, solução tampão, persulfato de amônio e TEMED. Agite bem e despeje imediatamente.

Não é necessário desgaseificar a poliacrilamida antes da polimerização. (A acrilamida costumava ser colocada em vácuo para remover bolhas, pois o oxigênio inibe a polimerização.)

Pontas de amostra de ponto de colagem horizontal.

· coloque um pedaço de papel preto na caixa de baixo, com fundo preto, para fazer alguns furos de amostra para ver mais claramente.
· tanque de cola cheio de tampão, logo acima do colóide.
· Se houver luz na borda, acenda as luzes e deixe a luz iluminar o coloide. Aspire a amostra para a pipeta.
· usando dispositivo de pipetagem automática.
· Em 10-200 μ, 1 ponto móvel de líquido pode ser usado na maioria dos pontos da amostra. Para furos de amostra muito pequenos (menos de 10 μ1), a cabeça longa da pipeta usada para sequenciamento de cola é mais conveniente.

· pipetar imerso na amostra, inalando o fluido em movimento lento. A amostra pode parecer pegajosa com glicerina, e o bombeamento rápido pode atrair bolhas de ar para a cabeça da pipeta.

· Após inalar a amostra, a cabeça da pipeta deve ser movida suavemente sobre a borda do tubo ou com papel absorvente para sugar o líquido para fora das gotas. Tenha cuidado para não sugar a amostra.

Coloque a amostra no orifício de amostra

· dispositivo de pipetagem para manter um pouco de pressão, faça as amostras moverem ligeiramente a cabeça do líquido de transbordamento.
· Insira a cabeça da pipeta no tampão, ligeiramente acima dos orifícios do ponto, mantendo a pressão positiva. A ponta da pipeta pode ser inserida em um pequeno orifício.
· Retire a amostra lenta e firmemente. A ponta da pipeta é colocada acima do orifício da amostra, e a amostra afundará no orifício. Deixe a amostra afundar para preencher o orifício em vez de empurrá-la para dentro.
· uma vez que a última gota da amostra com a cabeça líquida, o líquido se moverá para a segunda perna, aumente lentamente o movimento do líquido, saia do buffer

Como fazer amostragem de cola vertical?

· furos de amostra de ponto de cola vertical formados entre dois pedaços de vidro. Em cola muito fina, a cabeça da pipeta não consegue nem ser inserida entre duas placas de vidro. Cuidado com a glicerina! Coloque a cabeça da pipeta sobre o furo da amostra e a amostra afundará no furo.
· Antes de aplicar a amostra, certifique-se de que a ponta vertical do orifício da amostra de gel de polipropileno acílico esteja bem enxaguada. Lave a acrilamida não polimerizada e a água que possam se acumular no fundo do orifício da amostra. A água pode tornar o orifício da amostra significativamente menor. Use uma seringa de 25 ml ou 50 ml e uma agulha de calibre 18. Despeje o tampão de eletroforese e lave cuidadosamente o orifício da amostra.
· Pode ser difícil ver o orifício da amostra, mas, ao mesmo tempo, o resto é fácil. Se houver excesso de orifícios, o tampão da amostra pode ser testado com azul de bromofenol.